雜交瘤制備單克隆抗體實驗流程

利用雜交瘤制備單克隆抗體通常操作流程為：抗原制備、用抗原免疫動物、取免疫動物的脾臟細胞與骨髓瘤細胞融合成雜交瘤細胞、對雜交瘤細胞進行篩選及克隆化、利用篩選得到的雜交瘤細胞進行單克隆抗體的大量生產。

抗原制備

用于制備單克隆抗體的抗原純度越高，單抗制備實驗的成功率越高。一般來說，抗原可以是蛋白（天然蛋白或重組蛋白）、多肽、小分子等。

免疫動物

免疫動物的選擇

通常，根據所用的骨髓瘤細胞可選用小鼠或大鼠作為免疫動物。因為，所有的供雜交瘤技術用的小鼠骨髓瘤細胞系均來源于BALB/c小鼠，所有的大鼠骨髓瘤細胞都來源于LOU/c大鼠，所以一般的雜交瘤生產都是用這兩種純系動物作為免疫動物。就小鼠而言，一般選用6-8周齡雌性Balb/c小鼠。

制定免疫方案

免疫方案應根據抗原的特性不同而定，選擇合適的免疫方案對于細胞融合雜交的成功，獲得高質量的McAb至關重要。沒有一個免疫程序能適用于各種抗原，在設計免疫程序時，應考慮到抗原的性質和純度、抗原量、免疫途徑、免疫次數與間隔時間、佐劑的應用及動物對該抗原的應答能力等。現用的免疫程序與多克隆抗體制備的方法類似，免疫途徑常用體內免疫法包括皮下注射、腹腔或靜脈注射等。表1列舉了目前常用的免疫程序:

表1：常見的免疫程序

免疫動物

動物的免疫一般在融合前前兩個月，根據確定的免疫方案開始對動物進行初次免疫。動物的免疫通常共有三次，在初次免疫2~3周后進行再次免疫，在再次免疫3周后進行加強免疫（如果有需要的話）。一般來說，在最后一次加強免疫后第3天取脾進行融合較適宜。由不同抗原產生免疫反應的能力也有強有弱，因此在注射抗原的同時，常常會加入佐劑，以增強抗原的抗原性，刺激機體產生較強的免疫反應。

制備雜交瘤細胞

細胞融合前準備

脾淋巴細胞制備
已經免疫的BALB/c小鼠（或LOU/c大鼠），在無菌條件下去除脾臟，并完成脾淋巴細胞的制備。
注意：制備脾淋巴細胞過程中，通常也會進行小鼠眼球摘除采血的的操作，將血清分離后作為抗體檢測時陽性對照血清。
骨髓瘤細胞制備
骨髓瘤細胞應和免疫動物屬于同一品系，這樣雜交瘤融合效率高，也便于接種雜交瘤在同一品系小鼠腹腔內產生大量McAB。骨髓瘤細胞的培養可用一般的培養液，如RPMI1640，DMEM培養基。小牛血清的濃度一般在10%~20%，細胞濃度以10⁴~10⁵/ml為宜，最大濃度不得超過10⁶/ml。當細胞處于對數生長的中期時，可按1:3~1:10的比例傳代。每3~5天傳代一次。細胞在傳代過程中，部分細胞可能有返祖現象，應定期用8-氮鳥嘌呤處理，使生存的細胞對HAT呈均一的敏感性。
飼養細胞
在組織培養中，單個或少數分散的細胞不易生長繁殖，若加入其它細胞，則可使這些細胞生長繁殖，這種加入的細胞稱為飼養細胞。在細胞融合后選擇性培養過程中，由于大量骨髓瘤細胞和脾細胞相繼死亡，此時單個或少數分散的雜交瘤細胞多半不易存活，通常必須加入飼養細胞使之繁殖。常用的飼養細胞有：小鼠腹腔細胞、小鼠脾臟細胞或胸腺細胞。

細胞融合

進行雜交瘤制備的具體操作方法有多種，這里介紹比較常用的一種，讀者如果有興趣可以在網上找其他的操作方法：

1. 將骨髓瘤細胞與脾細胞按1:10或1:5的比例混合在一起，在50ml離心管中用無血清不完全培養液洗1次，離心，1200r/min 8分鐘，棄去上清，用吸管吸凈殘留液體（為了避免影響PEG的濃度），輕輕彈擊離心管底，使細胞沉淀略松動。
2. 用吸管在60s內（時間最好控制在45s左右）加預熱至40℃的50% PEG（PH 8.0） 1ml，邊加邊輕輕攪拌。
3. 用10ml吸管在90s內加20-30ml預熱的不完全培養基（終止PEG作用）；20-27℃靜置10分鐘。
4. 1000r/min 離心6分鐘，棄上清
5. 加入5ml HAT培養基，輕輕吹吸沉淀細胞，使其懸浮并混勻，然后補加含腹腔巨噬細胞的HAT培養基至80-100ml。
6. 分裝96孔細胞培養板（孔板內有飼養細胞層），每孔0.1-0.15ml（或分裝24孔板，每孔1.0-1.5ml），然后將培養板置37℃，6% CO₂培養箱內培養。
7. 5天后用HAT培養基換出1/2培養基
   1. 7-10天后用HT培養基換出HAT培養基；
   2. 經常觀察雜交瘤細胞的生長情況，待其長至孔底面積1/10以上時吸出上清供抗體檢測。

說明：上述步驟中，a~d為PEG介導的細胞融合，e~i為融合后的HAT篩選
融合細胞的篩選
脾細胞和骨髓瘤細胞經PEG處理后，形成多種細胞的混合體，只有脾細胞與骨髓細胞形成的雜交瘤細胞才有意義。在HAT選擇培養液中培養時，由于骨髓瘤細胞缺乏胸苷激酶或次黃嘌呤鳥嘌呤核糖轉移酶，故不能生長繁殖，而雜交瘤細胞具有上述兩種酶，在HAT選擇培養液可以生長繁殖。

雜交瘤細胞的克隆化

所謂克隆化是指使單個細胞無性繁殖而獲得該細胞團體的整個培養過程。通常在得到針對預定抗原的雜交瘤以后需連續進行2-3次克隆化，有時還需進行多次。克隆化的方法很多，如有限稀釋法、軟瓊脂法、單細胞顯微操作法、單克隆細胞集團顯微操作法和熒光激活細胞分類儀（FACS）分離法。（相關閱讀：雜交瘤細胞亞克隆常用方法）

雜交瘤細胞克隆化的意義

從原始孔中得到的陽性雜交瘤細胞，可能來源于二個或多個雜交瘤細胞，因此它們所分泌的抗體是不同質的。為了得到完全同質的單克隆抗體，必須對雜交瘤細胞進行克隆化。另一方面，雜交瘤細胞培養的初期是不穩定的，有的細胞丟失部分染色體，可能喪失產生抗體的能力。為了除去這部分已經不再分泌抗體的細胞，得到分泌抗體穩定的單克隆雜交瘤細胞系，也需要克隆化。另外，長期液氮凍存的雜交瘤細胞，復蘇后其分泌抗體的功能仍有可能丟失，因此也應作克隆化，以檢測抗體分泌情況。

雜交瘤細胞的凍存

雜交瘤細胞制備單克隆抗體的過程中，通常將一部分雜交瘤細胞凍存起來備用，便于以后大規模生產單克隆抗體以及避免外部不可測的影響因素對實驗帶來過大的影響。（雜交瘤細胞的凍存與復蘇）

利用雜交瘤細胞大規模生產單抗

利用雜交瘤細胞大量制備單克隆目前主要有兩種方法，一種是動物體內生產法，另外一種是體外培養法。

動物體內生產單抗的方法

鑒于絕大多數動物用雜交瘤均由BALB/c小鼠（或LOU/c大鼠）的骨髓瘤細胞與同品系的脾細胞融合而得，因此使用的動物首選BALB/c小鼠（或LOU/c大鼠）。將雜交瘤細胞接種于小鼠腹腔內，在小鼠腹腔內生長雜交瘤，并產生腹水，可得到大量的腹水單抗。該法操作簡便、經濟且抗體濃度很高。但是，腹水中常混有小鼠的各種雜蛋白（包括Ig），因此得到的腹水抗體要提純后才能使用。

體外培養法

體外培養可以采用單層細胞培養的形式，也可以采用懸浮培養的形式。細胞體外培養一定時間后，收集培養上清液，離心去除細胞及其碎片，即可獲得所需要的單克隆。抗體相較于免疫動物生產單克隆抗體的方法，體外培養不需要對得到的抗體進行純化，但該法的產量較低且費用昂貴。

抗體的檢測

檢測抗體的方法有多種，根據抗體類型的不同，可以選擇不同的篩選方法，一般以快速、簡便、特異、敏感的方法為優先。其中最常用的為酶聯免疫吸附實驗（ELISA）法。

ELISA的原理為：將使抗原（或抗體）結合到某種固相載體表面，使抗體（或抗原）與某種酶連接成酶標抗體（或抗原），將待測抗體與酶標抗體（或抗原）按不同的步驟與固相載體表面的抗原（或抗體）起反應。最終結合在固相載體的酶標抗體量與待檢測抗體的量呈一定比例。加入酶反應底物，底物被酶催化顯色，根據顏色的深淺便進行定性或定量分析。

其它常用的方法有:

• 放射免疫測定（RIA） 可用于可溶性抗原、細胞McAb的檢測。
• 免疫熒光試驗 適合于細胞表面抗原的McAb的檢測。
• 其它檢測方法如間接血凝試驗、細胞毒性試驗、旋轉粘附雙層吸附試驗等。

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