包涵體純化蛋白復性的方法操作流程
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包涵體的純化和復性總結
包涵體折疊復性的方法應具備以下幾個特點：較高的活性蛋白質回收率；復性產物易于與錯誤折疊蛋白質分離；折疊復性后能夠得到較高濃度的蛋白；折疊復性方法易于放大等。蛋白復性的過程通常分為以下幾個步驟：
包涵體的洗滌
包涵體在溶解之前需要進行洗滌，包涵體中主要含有重組蛋白，但也有一些雜質，如一些外膜蛋白、質粒DNA等，這些雜質會與包涵體粘連在一起，可以通過洗滌去除大多數雜質，但無法將雜蛋白去除干凈。
包涵體的洗滌通常選用濃度較低的變性劑，如2M尿素在50mM Tris，pH7.0-8.5，1mM EDTA中洗滌包涵體。此外可以用溫和去垢劑TritonX-100洗滌去除膜碎片和膜蛋白。同時，因為去垢劑的洗滌能力會隨溶液離子強度升高而加強，所以在洗滌包涵體時可加入低濃度的尿素或高濃度的NaCl，使包涵體的純度達到50%以上。
包涵體的溶解
變性劑如尿素、鹽酸胍，主要是通過離子間的相互作用，打斷包涵體蛋白分子間的各種化學鍵，使多肽延伸。鹽酸胍是較尿素強的變性劑，它能溶解尿素不溶的包涵體。SDS、正十六烷基三甲基銨氯化物、Sarkosyl等也可以破壞蛋白內的疏水鍵，溶解一些包涵體蛋白質。
另外，從某些含有半胱氨酸的蛋白質中分離出的包涵體，通常含有一些鏈間形成的二硫鍵和鏈內的非活性二硫鍵，這就還需加入還原劑，如巰基乙醇、二硫基蘇糖醇（DTT）、二硫赤蘚糖醇、半胱氨酸等。這種還原性試劑能夠同半胱氨酸形成各種二硫化物中間體，也會被復性用的二硫化物置換試劑所取代。二硫鍵的形成和斷裂是可逆的，直到最有利的蛋白二硫鍵形成，這個平衡才會被破壞。
| 常用變性劑對比 |
|---|
| 尿素（8-10M） | 較鹽酸胍慢而弱，溶解度為70-90% | 用尿素溶解具有不電離，呈中性，成本低，蛋白質復性后除去不會造成大量蛋白質沉淀
溶解的包涵體可選用多種色譜法純化 |
| 鹽酸胍（6-8M） | 溶解能力達95%以上，且溶解作用快而不造成重組蛋白質的共價修飾 | 成本高、在酸性條件下易產生沉淀、復性后除去可能造成大量蛋白質沉淀
對蛋白質離子交換色譜有干擾 |
包涵體的復性
復性是指通過去除變性劑使目標蛋白從完全伸展的變性狀態恢復到正常的折疊結構，同時去除還原劑確保二硫鍵正常形成。一般在尿素濃度4M左右時復性過程開始，到2M左右時結束；鹽酸胍可以從4M開始，到1.5M 時結束。復性方法主要采用稀釋復性，透析復性和柱上復性，具體對比如下：
| 復性技術 | 簡介 | 優點 | 缺點 |
|---|
| 稀釋復性 | 用折疊緩沖液快速稀釋溶解的包涵體蛋白質溶液，達到降低變性劑濃度的目的，使去折疊的蛋白質進行再折疊 | 簡單 | 慢
蛋白會被稀釋到很低濃度
體積增加較大，變性劑稀釋速度太快，不易控制 |
| 透析復性 | 通過逐漸降低外透液濃度來控制變性劑去除速度 | 簡單
不增加體積 | 慢
使用大量緩沖液
不適合大規模操作，無法應用到生產規模 |
| 分子篩層析 | 分子篩效應可將蛋白質和小分子變性劑分離，實現溶液交換和蛋白質的折疊 | 在一步操作中直接進行自動化復性并純化 | 樣品體積受限 |
| 離子交換層析 | 減少導致蛋白質聚集的分子間相互作用，可將蛋白質結合在分離介質上，達到溶液中變性劑濃度的稀釋和蛋白質的折疊 | 快速并簡單
直接進行自動化 | 應避免使用與離子交換自相反電荷的添加 |
復性的檢測
根據具體的蛋白性質和需要，可以從生化、免疫、物理性質等方面對蛋白質的復性效率進行檢測。
- 凝膠電泳：一般可以用非變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳可以檢測變性和天然狀態的蛋白質，或用非還原的聚丙烯酰胺電泳檢測有二硫鍵的蛋白復性后二硫鍵的配對情況。
- 光譜學方法：可以用紫外差光譜、熒光光譜、圓二色性光譜（CD）等，利用兩種狀態下的光譜學特征進行復性情況的檢測，但一般只用于復性研究中的過程檢測。
- 色譜方法：如IEX、RP-HPLC、CE等，由于兩種狀態的蛋白色譜行為不同。
- 生物學活性及比活測定：一般用細胞方法或生化方法進行測定，較好的反映了復性蛋白的活性，值得注意的是，不同的測活方法測得的結果不同，而且常常不能完全反映體內活性。
- 黏度和濁度測定：復性后的蛋白溶解度增加，變性狀態時由于疏水殘基暴露，一般水溶性很差，大多形成可見的沉淀析出。
- 免疫學方法：如ELISA、WESTERN等，特別是對結構決定簇的抗體檢驗，比較真實的反映了蛋白質的折疊狀態。
蛋白復性過程的添加劑
- 共溶劑：如PEG6000-20000，據說可以可逆的修飾折疊中間體的疏水集團，此外由于阻止了蛋白質分子間的相互接觸的機會，也可能對復性效率的提高起作用。一般的使用濃度在0.1%左右，具體條件可根據實驗條件確定。
- 二硫鍵異構酶（PDI）和脯氨酸異構酶（PPI）：PDI可以使錯配的二硫鍵打開并重新組合，從而有利于恢復到正常的結構，此外在復性過程中蛋白質的脯氨酸兩種構象間的轉變需要較高能量，常常是復性過程中的限速步驟，而PPI的作用是促進兩種構象間的轉變，從而促進復性的進行。
- 分子伴侶，即熱休克蛋白（HSP），是一種沒有蛋白質特異性的促進折疊的蛋白因子，研究發現很多蛋白在缺乏分子伴侶時無法自己正確的折疊。有人構建了與伴侶分子共同表達的菌株，據說效果不錯。不過在生產中還沒有看到2和3的應用的例子。
- 0.4-0.6ML-Arg：成功的應用于很多蛋白如t-PA的復性中，可以抑制二聚體的形成。
- 甘油：增加黏度，減少分子碰撞機會，一般使用濃度在5%-30%。
- 輔助因子：添加蛋白質活性狀態必須的輔助因子如輔酶輔基等或蛋白配體等很多時候對蛋白質正確的折疊是有利的。 色譜法：通過將目標蛋白結合到層析柱上，減少蛋白分子間的相互影響，該方法得到越來越多的應用，常用的色譜有SEC、HIC、IEC、IMAC等。
案例介紹
包涵體沉淀的溶解、重折疊和離子交換層析
材料和設備
Tiss-Tearor 勻漿器
透析袋（Spectra/Por?6）
陽離子交換柱
SDS-PAGE電泳裝置
試劑
緩沖液A（1000mL）
1mol/L Tris-HCl（PH 7.9）50mL，50mmol/L
0.5mol/L EDTA 1mL，0.5mmol/L
5mol/LNaCl 10ml，50mmol/L
甘油 50mL，5%
緩沖液A+50%甘油
脫氧膽酸鈉（DOC）
N-十二烷基胺酸鈉（SKL）
操作程序
用N-十二烷基胺酸鈉溶解包涵體沉淀
- 加18mL緩沖液A和2mL 20% DOC儲存于包涵體沉淀中。用組織破碎器充分重懸沉淀，室溫下靜置至少10min。
- 懸液于4℃、13000r/min離心10min。棄去上清（注意留樣，樣品C），為確保沉淀得到充分洗滌，再次按步驟一的操作重懸沉淀。將懸液分成倆個相等的部分，編號#1和#2，于4℃、13000r/min離心10min。
- 對#1管中的沉淀，加19.7mL的緩沖液A和0.3mL的20%SKL儲液。劇烈攪動使沉淀慢慢溶解。然后靜置30min。
- #1管中溶解的蛋白懸液，置于4℃、13000r/min離心10min。收集上清液，棄去沉淀。
透析除去去污劑使可溶性蛋白重折疊
- 對溶解的物料進行蛋白定量測定（制作標準曲線時，必需用含有0.3% SKL的牛血清蛋白）。用緩沖液A+0.3% SKL稀釋，將溶解的蛋白濃度調至1mg/mL。
- 用緩沖液A將溶解蛋白制備液稀釋10倍，使蛋白終濃度約為0.1mg/mL，SKL終濃度約為0.03%。
- 4℃下，溶解蛋白制備物（約200mL），用2000mL緩沖液A透析8h（每4h，取150uL樣品，用HPLC測定去垢劑含量），同時充分攪拌。然后換新鮮緩沖液并重復。
離子交換層析
- 從透析袋中移出經透析的蛋白質溶液，4℃、8000r/min離心20min，除去所有聚集物。
- 留上清（樣品J），加載于POROS 50S陽離子交換柱，作為后一級的分級分離。
- 用緩沖液A洗滌層析用的介質，然后將其傾入帶適配器接頭的玻璃柱中，裝成一總體積為5mL的層析柱。用緩沖液A+1mol/L NaCl洗柱。并用緩沖液A平衡柱子。
- 如透析是在低鹽環境下進行，則可在室溫下以4mL/min的流速直接將蛋白樣品加載于層析柱上。
- 用緩沖液A洗柱15min，然后在60min內，以4mL/min的流速，進行梯度洗脫（0-1mol/L NaCl/緩沖液A）。檢測260nm和280nm處的吸收，分部收集4mL組分。
- SDS-PAGE電泳分析各組分，并合并峰組分進行進一步分析。合并的組分可通過對緩沖液A+50%透析，制備后儲存。
注：更多有關包涵體蛋白復性的操作注意事項和問題解答，請訪問：包涵體復性常見問題FAQ
